基因序列ORF分析（基于EMBOSS）

ORF介绍:

开放阅读框（Open Reading Frame，ORF，开放阅读框架、开放读架等）是指在给定的阅读框
架中，不包含终止密码子的一串序列。这段序列是生物个体的基因组中可能作为蛋白质编码序列的
部分，包含从 5’ 端翻译起始密码子（AUG）到终止密码子（UAA、UAG、UGA）之间的一段编码
蛋白质的碱基序列。由于一段 DNA 或 RNA 序列有多种不同读取方式，因此可能同时存在许多不同的开放阅读框架。

对于任何给定的核酸序列，根据密码子的起始位置，可以按照三种方式进行解释，其反向互补 序列又含有三种。因此，一条 DNA 序列可以按六种框架阅读和翻译。ORF 的识别需要检测这六个 阅读框架并决定哪一个包含以起始密码子和终止密码子为界限的 DNA 序列而其内部不包含终止密 码子，识别出蛋白质序列最长的 ORF。长的 ORF 往往不是偶然发生的，所以在任何阅读框中存在 300bp 或更长的未中断的编码序列是判断一个基因的重要依据。

一个 ORF 存在一个潜在的编码序列（Coding DNA Sequence，CDS），不同的 ORF 翻译成氨 基酸可以得到不同的蛋白质编码。一个 ORF 对应一个候选的CDS,分析 DNA 序列中的ORF是对该序列是否为CDS的初步判断，是研究DNA序列片段的方法之一。用于ORF分析的软件一般使用ORF Finder。
百度百科：ORF开放阅读框

软件介绍:

EMBOSS（European Molecular Biology Open Software Suite）软件包是一个开源的序列分析软 件包，该软件包源于 1988 年开始开发的 EGCG 系统，是一组为分子生物学家所设计的公开且免费 的软件。它整合了目前可以获得的大部分序列分析软件并有一套专门设计的 C 语言函数。该软件 包含 160 多个小型程序，能够自动识别处理以不同格式存储的数据，甚至可以通过互联网提取数 据，能很好地进行序列模体挖掘、关键词同源性数据库搜索、序列比较、进化分析、序列二级结构 分析、限制性酶切图谱分析、引物设计、序列模式识别与翻译、片段拼接等工作，可以满足一般 实验室的各种各样的序列分析要求。同时它提供了一个扩展库，以方便科学家依据自由软件精神 编制、发布软件。使用 EMBOSS，可以将系列分析工作进行无缝整合，弥补了很多其他软件功能 分散、分析效率底下的缺陷。EMBOSS 遵照 GPL 协议，打破了商业软件包发展的传统模式，使科 研工作者自由、免费的使用功能强大的分析工具。使用者可以通过三种不同的方式使用 EMBOSS 软件：第一种是通过命令行的方式；第二种是通过 X-Windows 的方式使用 EMBOSS 软件的图形界 面；第三种是联网的方式。使用者可以免费获得这些软件以及相关界面程序。EMBOSS 的主页网 址为 http://emboss.sourceforge.net。

​ EMBOSS 软件包主要运行于 Linux 操作系统和 Mac 操作系统。现在基于 Windows 操作系统的 EMBOSS 也能自由免费使用。需要说明的是基于 Windows 操作系统时，主要采用 Staden 进入 EMBOSS，在使用时，需要安装 Embosswin 软件。Embosswin 的下载网址是：ftp://emboss.open-bio.org/ pub/EMBOSS/wEMBOSS Explorerindows

​ EMBOSS源码是完全开源的，其核心程序的基本设计与各种开发平台相兼容，可以供研究人 员作为开发应用程序的平台，不同的机构也因此开发了各种 EMBOSS 使用界面，包括 Jemboss、 Other GUIs、Web interfacaes、Workfolws、Ports and packages 等（这些几乎都是需要实打实的安装在电脑上的）。 接下来我们要用的是：

EMBOSS Explorer：

​ EMBOSS Explorer 是 Web interfaces 的一种界面，利用 EMBOSS Explorer 可将 EMBOSS 软件从单机版变为网络版，可以让更多的人享用已有的分析平台。这个版本 适合安装在服务器上，提供在线分析。EMBOSS Explorer 的主界面，左边的区域是程序列表， 右边的区域是执行程序区域。

EMBOSS.PNG

​ 正如图片所见，EMBOSS的功能非常丰富，今天我们需要用到的就两个：

  1. extractseq——用于截取一段基因片段。
  2. getorf——用于具体片段的ORF的分析。

操作过程：（以大肠杆菌基因组序列的ORF分析为例）

  1. 获取序列。登录NCBI主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ )，在核酸（Nucleotide）数据库查询大肠杆菌基因组序列（U00096），将其以FASTA格式保存到本地计算机上。

  2. 打开EMBOSS。有 http://emboss.bioinformatics.nl/ 和 http://genome.csdb.cn/emboss/ 多个EMBOSS Explorer可供选用，任选其一打开链接即可使用。

  3. 截取序列。找到EMBOSS中的程序extractseq，在Required section项目中，通过设定Regions to extract为1-3000截取大肠杆菌基因组序列的前3000bp。点击运行后，点击outseq，然后ctrl+A选中全部，ctrl+C复制。回到桌面，新建一个TXT文件，修改后缀名为fasta。将刚刚复制的片段粘贴进去，保存名字为coli_part.fasta待用。

    Tips：EMOBSS由于程序太多，寻找起来非常复杂，推荐直接在地址栏键入，如图：

    dizhi.PNG

    地址栏一定不能输错了，更改红色部分为程序名即可

  4. ORF预测。（找到程序getorf，在序列输入框中粘贴上一步截取的前3000bp序列片段），Code to use中选择“Bacterial”，Type of output中选择“Nucleic sequences between START and STOP codons”，其他默认即可。之后点击Run getorf得到ORF的预测结果。

    EMOBOSS_output.PNG

  5. 和NCBI的ORF Finder预测结果进行比较分析。tip：两个的输出结果有所不同，不代表哪一个有错，本就是一个预测，可能由于各个软件的算法以及数据存储结构不同造成结果差异

    附1：ORF Finder预测：

    ORF Finder在您输入的 DNA 序列中搜索ORF。该程序返回每个ORF的范围及其蛋白质翻译。使用 ORF 查找器搜索新测序的 DNA 以查找潜在的蛋白质编码片段，使用新开发的 SMART BLAST 或常规 BLASTP 验证预测的蛋白质。地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/

    tips：ORF Finder所给到的信息更多，但是ORF Finder不支持直接文件导入。ORF Finder最大支持50kb基因长度，大肠杆菌长度约4 70kb，不能直接全复制进去，需要手动处理or用EMBOSS的extractseq剪切，长了会报错，如图

    erro.PNG

    将前面保存的coli_part.fasta里面的全复制进去，运行后，我的结果如下;

    finder_output.PNG

    ​ ORF Finder教程：https://zhuanlan.zhihu.com/p/465101247

    附2：NCBI数据库下载基因组序列：

  • 打开NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；

  • 选择搜索栏左边选项选择你想要的数据库类型，这里以Nucleotide库为例.

  • 选择send，保存为file，选择fasta格式。

send.PNG

  • 选择保存位置，默认命名为sequence.fasta。由于NCBI服务器在国外，下载速度比较慢，在下载完整sequence时会有比较明显的感知。（下载速度只有10-30kb/s)

download.PNG

NCBI数据库使用方法教程：https://www.51xxziyuan.com/55/5943.html 他说他是最详细的教程

引用及参考：

1.《生物信息学》（李霞，人民卫生出版社），

2.天津医科大学《生物信息学基础》课程，伊现富博士

3.NCBI，百度百科

4.大肠杆菌，百度百科